Дженнифер Энистон родилась в городке Шерман Оукс (штат Калифорния, США) в семье американского актёра Джона Энистона (урождённый Яннис Анастассакис, родом с о. Крит) и Нэнси Доу (англ.), актрисы с шотландскими и итальянскими корнями. У Дженнифер есть два брата — Джон Мелик (старший) и Алекс Энистон (младший). Крёстный отец Энистон — греко-американский актёр Телли Савалас, лучший друг её отца.

Когда девочке было 9 лет, её родители развелись. Она осталась с матерью, но часто ездила к отцу в Лос-Анджелес, где Джон Энистон играл одну из главных ролей в сериале «Дни нашей жизни». В 11 лет Дженнифер начала играть в драматическом кружке школы Рудольфа Штайнера. Своё профессиональное обучение она продолжила в нью-йоркской школе актёрского мастерства в 1987 году.

После её окончания она участвовала в нескольких бродвейских постановках («For Dear Life», «Dancing on Checker’s Grave» и др.). В этот период Энистон также подрабатывала курьером и занималась телефонным маркетингом.